Klonierung – angewandte Gentechnik

Klonierung – angewandte Gentechnik

Das Wort „Gentechnik“ ist in aller Munde. Am ehesten hast du von der Gentechnik sicher schon etwas im Zusammenhang mit Lebensmitteln gehört. Wenn du einmal im Supermarkt durch die Abteilung der Milchprodukte gehst und ein paar Packungen Käse von unterschiedlichen Marken vergleichst, dann wirst du schnell feststellen, dass auf einigen Verpackungen das Label „ohne Gentechnik“ zu lesen ist. Doch was ist eigentlich Gentechnik? Ist das etwas Gutes oder sollte man vor allem darauf achten, Käse ohne Gentechnik zu essen? Diese und noch viele weitere Fragen möchten wir dir in diesem Text beantworten, indem wir dir eine bekannte molekulare Methode vorstellen – die Klonierung. Dafür stellt sich als Allererstes die Frage: Was ist Klonierung?

Klonierung – Definition

Klonierung ist in der Biologie ein Überbegriff für Methoden zur Gewinnung und identischen Vervielfältigung von DNA. Der Begriff Klonierung ist dabei klar abzugrenzen von dem Begriff Klonen, der die Herstellung genetisch identischer Organismen beschreibt. Der Prozess der Klonierung besteht aus mehreren molekularen Methoden, die in aufeinanderfolgenden Schritten kombiniert werden. Diese Schritte stellen wir dir nun am Beispiel der menschlichen Insulinherstellung in der pharmazeutischen Industrie vor.

Pharmazeutisches Insulin als Lebensretter

Insulin ist ein menschliches Hormon, das nach der Nahrungsaufnahme, wenn der Blutzuckerspiegel steigt, von den Zellen der Bauchspeicheldrüse freigesetzt wird. Es reguliert den Blutzuckerspiegel, indem es zu einer Aufnahme von Traubenzucker, also Glucose, in die Leber, in die Muskeln und in das Fettgewebe führt. Es gibt verschiedene Formen von Diabetes mellitus, der sogenannten Zuckerkrankheit. Bei einer Form von Diabetes, dem Diabetes Typ I, ist das Gen für das Insulin kaputt und der Körper kann kein eigenes Insulin mehr produzieren. Damit kann der Körper nicht ausreichend Zucker in die Gewebe aufnehmen. Vor der Entdeckung des Hormons Insulin im Jahr 1921, also vor genau 100 Jahren, war die Entdeckung der Krankheit damit meistens ein Todesurteil, da die Menschen unkontrolliert dünner wurden, bis der Körper nicht mehr genug Energie zum Überleben hatte.

Bereits 1923 wurde das erste Insulin-Medikament entwickelt, das damals aus der Bauchspeicheldrüse von Schweinen gewonnen wurde. Im Jahr 1982, also circa 60 Jahre nach der Entdeckung des Insulins, konnte endlich das erste gentechnisch hergestellte, menschliche Insulin zugelassen werden, was nicht nur Millionen von Menschenleben, sondern auch das Leben von Milliarden von Schweinen rettete.

Schritte der Gen-Klonierung

Für die gentechnische Herstellung von Insulin benötigt man inzwischen nur noch das Darmbakterium E. coli, das im Labor zum Träger des menschlichen Insulingens gemacht wird und damit menschliches Insulin produziert. Wie das funktioniert, erklären wir dir nun Schritt für Schritt.

Vektoren als Träger des Wunschgens

Bakterienzellen enthalten neben ihrem ringförmigen Chromosom weitere kleinere, ringförmige DNA-Moleküle, die Plasmide. Diese Plasmid-DNA ist normalerweise nicht überlebensnotwendig, aber sie enthält zusätzliche Gene, die auf dem Ringchromosom nicht vorhanden sind und den Trägerbakterien so zusätzliche Eigenschaften verleihen, ähnlich wie ein Add-on. Isoliert man diese Plasmide nun aus dem Bakterium, kann man mittels molekularbiologischer Methoden ein gewünschtes Gen in das Plasmid einfügen und das Plasmid zurück in das Bakterium transformieren. Das gentechnisch veränderte Plasmid nennt man auch Vektor.

In unserem Beispiel des Insulins handelt es sich um ein menschliches Gen, das in das bakterielle Plasmid eingefügt werden soll. Daher müssen zuvor noch einige Modifikationen vorgenommen werden. Da Menschen Eukaryoten und Bakterien Prokaryoten sind, unterscheidet sich der Aufbau ihrer Gene. Ein eukaryotisches Gen ist in Exons und Introns gegliedert. Die Exons sind die Träger der genetischen Information für das Protein. Zwischen den Exons liegen die Introns, die keine für das Gen codierenden Informationen enthalten. Bakterielle Gene hingegen weisen keine Introns auf. Somit haben Bakterien auch keine Enzyme für die RNA-Prozessierung, wie das Spleißen, um die Introns aus der transkribierten RNA herauszuschneiden. Würde man die DNA inklusive Introns in das Bakterium einbringen, könnte dieses also nicht das gewünschte Protein herstellen. Es wird daher eine DNA ohne Introns benötigt, zum Beispiel eine sogenannte cDNA.

Herstellung von cDNA für die Klonierung

Bei der Transkription wird im ersten Schritt prä-mRNA hergestellt. Dabei handelt es sich um einen Einzelstrang, der eine komplementäre Kopie des gewünschten Gens ist und sowohl die darin enthaltenen Introns als auch Exons enthält. Beim Spleißen werden die Introns herausgeschnitten und es entsteht eine reife mRNA. Diese mRNA kann aus den menschlichen Zellen isoliert werden und im Reagenzglas mithilfe einer reversen Transkriptase wiederum in ein komplementäres DNA-Molekül überführt werden. Diesen Prozess nennt man reverse Transkription. Das entstehende Molekül heißt cDNA, kurz für complementary DNA, was das englische Wort für komplementäre DNA ist. Bei der cDNA handelt es sich um einsträngige DNA, die in einem weiteren Schritt zu einem Doppelstrang ergänzt wird. Wir erhalten somit doppelsträngige cDNA für die Klonierung, die nur Exons und keine Introns aufweist.

Herstellung eines Klonierungsvektors – Restriktion

Noch einmal zur Wiederholung: Bei einem Vektor handelt es sich um gentechnisch veränderte Plasmid-DNA, die als Genfähre oder Gentaxi verwendet wird, um ein gewünschtes DNA-Fragment in ein Bakterium einzubringen. Um im zweiten Schritt der Klonierung den Vektor herzustellen, benötigt man eine sogenannte Genschere, die das bakterielle Plasmid öffnet, damit das gewünschte DNA-Fragment eingefügt werden kann. Diese Genscheren heißen Restriktionsenzyme. Sie schneiden DNA an spezifischen Basensequenzen, genau wie eine molekulare Schere, sodass die aufgeschnittenen Enden der DNA immer genau die gleiche Basensequenz an ihrem Ende tragen. Schneidet man sowohl den Vektor als auch unsere Insulin-cDNA mit dem gleichen Restriktionsenzym, entstehen an beiden Molekülen Enden, die genau wie zwei Puzzleteile zusammenpassen. Diese Enden sind komplementär zueinander und man nennt sie auch sticky ends, also klebrige Enden.

Herstellung eines Klonierungsvektors – Ligation

In einem weiteren Schritt, der Ligation, gibt man das Enzym Ligase zu seinem Reaktionsmix aus geschnittener Insulin-cDNA und geschnittenem Vektor. Diese Ligase klebt die sticky ends zusammen, genauer gesagt verbindet sie die 3′- und 5′-Enden der DNA. Es entsteht wieder eine ringförmige Plasmid-DNA, unser Vektor, bei dem es sich um rekombinante DNA handelt.

Transformation

Im nächsten Schritt erfolgt der eigentliche Transfer des Vektors in die Bakterienzelle. Diesen Prozess nennt man Transformation. Dafür wird der Vektor zusammen mit einem geeigneten, robusten und teilungsfreudigen Bakterium wie E. coli in ein Reaktionsgefäß gegeben und entweder mit elektrischen Impulsen, bestimmten Chemikalien oder kurzer Hitze behandelt, sodass die Zellwand für einen kurzen Moment durchlässig gemacht wird und die Bakterienzellen den Vektor aufnehmen. Da das nicht in jeder einzelnen Bakterienzelle funktioniert, muss im Anschluss eine Selektion durchgeführt werden.

Selektion

Indem man gemeinsam mit dem Insulingen auch ein Gen für eine Antibiotikaresistenz in den Vektor einbringt, kann man die Bakterien im Anschluss an die Transformation selektieren, indem man sie auf einen Nährboden mit einem Antibiotikum aufträgt. Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, tragen auch das Resistenzgen und können trotz Antibiotikum auf dem Nährboden wachsen. Bakterien, die das Plasmid nicht aufgenommen haben, tragen auch die Resistenz nicht und sterben durch das Antibiotikum ab.

Insulinproduktion

Die gewachsenen Bakterienkolonien können nun in ein größeres Gefäß mit flüssigem Nährmedium überführt werden und dürfen sich dort weiter vermehren. Es handelt sich um identische Klone, die alle das Plasmid mit dem Insulingen tragen. Daher spricht man bei dem Vorgang von Plasmidklonierung. Durch Proteinbiosynthese produziert die Bakterienzelle nun fortwährend das Insulin. Da sich die E. coli-Zelle alle 20 Minuten teilt, verdoppelt sich alle 20 Minuten die Anzahl an Insulin produzierenden Zellen. In sehr großen Gefäßen, sogenannten Fermentern, die zum Teil mehrere 1 000 Liter Medium mit Bakterien beinhalten, können Pharmafirmen so große Mengen Insulin produzieren, dass die große Anzahl an Diabetikern weltweit jederzeit ausreichend versorgt ist. Dafür wird in einem letzten Schritt das Insulin durch das Aufbrechen der Zellen freigesetzt und mit speziellen Methoden aufgereinigt, sodass es als reines Medikament nutzbar ist.

In der Abbildung siehst du den gesamten Prozess der Klonierung des Insulingens noch einmal schematisch dargestellt.

Klonierung in der Nahrungsmittelindustrie

Es gibt noch viele weitere Anwendungsgebiete für die Gentechnik. Eines davon ist die Nahrungsmittelindustrie. Labenzym für die Käseherstellung wird traditionell aus Kälbermägen gewonnen und der Milch zugesetzt, damit diese zu Käse eindickt. Durch Gentechnik ist es möglich, das Gen für das Labenzym in Bakterien einzubringen, sodass die Bakterien es im großen Maßstab produzieren. Der Hinweis, dass ein Käse „ohne Gentechnik“ hergestellt wurde, zeigt damit also nicht an, dass der Käse genetisch unverändert ist oder ob er besser oder gesünder ist, sondern in der Regel nur, dass die Enzyme für die Käseherstellung nicht aus transgenen Mikroorganismen und somit aus Kälbermägen oder anderweitig gewonnen wurden.

Klonierung – Zusammenfassung

In diesem Text haben wir dir einfach erklärt, was die Klonierung von DNA ist und wie sie funktioniert. Dafür haben wir den genauen Ablauf der Klonierung von cDNA besprochen. Es folgte eine Erklärung der Anwendung und Bedeutung von Klonierung. Dabei hast du gelernt, wie wichtig Klonierung in der Gentechnik ist, und du hast verschiedene Beispiele der Klonierung in der Medizin und der Nahrungsmittelindustrie kennengelernt. Im Anschluss an das Video und den Text kannst du dein Wissen in interaktiven Übungen testen. Falls du noch mehr über die Gentechnik wissen möchtest, kannst du dir die Videos Gentechnik und Lebensmittel, Gentechnik bei Tieren oder Werkzeuge der Gentechnik ansehen. Viel Spaß!